DIAGNOSTIC DE LABORATOIRE

Quatre espèces plasmodiales infectent habituellement l'homme: P. falciparum, P. vivax, P. malariae et P. ovale. La plus notoire de ces espèces , P. falciparum, peut rapidement entraîner la mort et se trouve à l’origine de la majorité des cas fatals de malaria.

Le paludisme sévit dans la plupart des régions tropicales du monde, avec une prédominance de P. falciparum en Afrique, en Nouvelle-Guinée et à Haiti. P.vivax se rencontre communément dans le sous-continent indien et en Amérique Centrale, la prévalence des deux infections étant plutôt égales en Asie, en Océanie et en Amérique du Sud. P. malariae est présente dans presque toutes les régions où le parasite est endémique, en particulier au sud du Sahara mais elle est moins fréquente. P. ovale est rare hors du continent africain bien qu’un certain nombre de cas aient été identifiés dans d’autre régions (les Etats méridionaux de l’Inde par exemple). Par ailleurs, il est impérieux de reconnaître qu’avec la rapidité et la facilité des transports modernes et des mouvements de population, des cas "importés" de malaria peuvent apparaître n’importe où. De plus ce qu’on appelle la malaria d’aéroport (voir section historique) ont été détectés dans plusieurs pays don’t les USA, le Royaume Uni, la Belgique et la Suisse. La malaria d’aéroport est particulièrement dangereuse parceque les cliniciens ont très peu de raison de la suspecter si le patient n’a pas eu de récents déplacements dans des régions où la maladie est endémique. Ce qui peut résulter en un délai dans l’établissement d’un diagnostic correct et, par conséquent, la mort avant qu’un traitement approprié puisse être administré.

Ces dernières années, un nombre de nouvelles techniques fondées sur le test immunochromatographique du sang complet ont été développées pour le diagnostic de la malaria. Parmi elles figurent les produits ICT Malaria, P.f/ P.v (pour la détection qualitative et la différentiation des antigènes Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax), OptiMalr et les kits Kat-quick. Ces méthodes reposent sur le principe de la détection de la protéine-2 (HRP-2) riche en histidine plasmodiale ou de déshydrogénase de lactate (pLDH) qui est plus spécialisée - étant présente dans les infections de P.falciparum. Plusieurs rapports font état de sensibilité et spécificité proche des 100% alors que d’autres constatent jusqu’à 6% de réaction croisée en cas de présence du facteur rhumatoïde. Certains de ces tests immunochromatographiques du sang complet ont été étendus à la détection d’autres formes de paludisme sans que, jusqu’ici, les résultats aient été vraiment probants.

Les tests immunochromatographiques rapides du sang complet ont le potentiel de rendre plus rapide et plus précis le diagnostic de P. falciparum dans les laboratoires non spécialisés en particulier, où travaille un personnel jeune et inexpérimenté étant donné le peu de formation exigé par ces techniques. Dans ce laboratoire, nous avons trouvé les tests immunochromatographiques du sang complet très valable pour le dépistage et la confirmation, spécialement en cas de difficulté à identifier des formes en anneau ténues dans des frottis sanguins. Leur utilité s'est révélé déterminante après les heures, quand des employés moins expérimentés étaient de service. Cependant les méthodes immunochromatographiques de sang complet ne peuvent indiquer la quantité de parasites sans compter le fait d’être d'un coût prohibitif dans certains pays. Un problème potentiel avec ces méthodes est que la présence de l’antigène dans le sang peut être notée pendant plusieurs jours (jusqu’à deux semaines dans notre laboratoire) même après l’élimination des parasites viables de la circulation sanguine. Qu'il nous soit permis d'insister que nous considérons ces méthodes comme des tests utiles pouvant s'ajouter à la méthode longuement établie de l'examen de la goutte épaisse et du frottis sanguin (résumé ci-dessous), qui est toujours considérée comme l'étalon-or, pas comme le substitut.

L’examen de la goutte épaisse doit constituer la première étape étant donné qu’elle présente l’avantage de concentrer 20 fois plus de parasites qu’un frottis mince bien que les parasites puissent paraître déformés, rendant leur identification difficile. Si la présence de parasites est détectée, l’espèce devra alors être identifiée par l’examen du frottis mince. Dans l’idéal le sang devra être pris quand la température du patient est à la hausse.

Préparation de la goutte épaisse et du frottis sanguin :

Goutte épaisse : déposez une goutte de sang au milieu d'une lame de microscope bien nettoyée et, à l'aide du coin d'une autre lame propre, étalez la goutte de sang jusqu'à obtenir un diamètre de 10 à 15 mm. L'étalement doit être d'une épaisseur à travers laquelle il soit possible de voir les caractères d'un journal. Les frottis sont réalisés de manière standard. Laissez sécher les étalements mais ne les déposez pas sur une paillasse de laboratoire qui n'est pas à l'abri des mouches au risque qu’ils soient mangés.

Lorsque les étalements sont secs, fixez et colorez le frottis mince selon la méthode conventionnelle en faisant attention au pH du colorant; un pH légèrement alcalin (pH 7.2) est recommandé. Une coloration acide pourrait empêcher la mise en évidence des parasites. Quand un petit nombre d’étalements de la goutte épaisse doivent être colorés, un meilleur résultat est obtenu avec le colorant de Giemsa dilué (1/20); utilisez une cuve de coloration (Jarre de Coplin) et faites en sorte que la lame soit en position verticale, ce qui permettra aux débris de se déposer au fond de la cuve. Colorez pendant environ 30 mn, lavez doucement et laissez sécher. Utilisez un contrôle positif si possible. Quand un grand nombre de gouttes épaisses doivent être colorées, le colorant de Field est indiqué parce que son effet est plus rapide. Le colorant de Field comprend deux solutions; un bleu de méthylène polychrome (A) et l’éosine (B). Les solutions sont gardées dans des jarres de coloration couvertes.

  1. Trempez l’étalement sec mais non fixé dans la solution A pour 1 ou 2 secondes.
  2. Retirez-le de la solution A et rincez immédiatement dans de l’eau propre (un vase à bec plein d’une eau qui coule lentement conviendrait en la circonstance).
  3. Plongez le film dans la solution B pour 1 ou 2 secondes.
  4. Rincez-le à l’eau propre pour quelques secondes.
  5. Mettez-le à sécher dans une position verticale.

Si les étalements sont vieux ou trop épais, les hématies risquent de ne pas se rompre complètement dans le court laps de temps dévoué à la coloration. Si cela est à prévoir, trempez l’étalement dans de l’eau propre pendant quelques secondes (ou jusqu’à ce que l’hémoglobine soit dispersée avant de le colorer. Le mode d’emploi du colorant de Field figure dans de nombreux manuels de laboratoire.

Au microscope, examinez premièrement la goutte épaisse en utilisant de l'huile à immersion ou à l'aide d'une lentille spéciale pour déterminer la présence ou non de parasites. Faites attention au nombre de plaquettes et de leucocytes du patient. Le paludisme est d'habitude associé à un taux normal ou bas de leucocytes. La leucocytose est seulement observée pendant la phase terminale de la maladie. Le nombre de plaquettes est modérément ou considérablement diminué chez 80% des patients atteints de malaria. Les parasites peuvent paraître déformés si le patient a déjà été traité ou s'il a reçu une prophylaxie inadéquate.

Les images montrent les caractéristiques des quatre espèces.


Critères de diagnostic :-

  1. Les hématies ne sont pas hypertrophiées
  2. Les trophozoïtes (formes en anneau) apparaissent très fins et fragiles et il peut y en avoir plusieurs à l'intérieur d'une cellule
  3. Certains trophozoïtes peuvent avoir deux grains de chromatine.
  4. La présence de formes marginales ou appliquées
  5. Il est inhabituel de voir des formes en développement sur des étalements de sang périphérique
  6. Les gamétocytes sont caractérisés par des formes en croissant ou faux. Cependant, ils n'apparaissent pas habituellement dans le sang pendant les quatre premières semaines de l'infection.
  7. Des tâches de Maurer peuvent être présentes.

Critères de diagnostic :-

  1. Les hématies parasitées sont habituellement hypertrophiées
  2. Les granulations de Schüffner sont fréquemment observées dans les hématies comme ci-dessus.
  3. Les trophozoïtes matures ont tendance à devenir plus larges et grossiers.
  4. Les formes en développement sont fréquemment rencontrées

Critères de diagnostic :-

  1. Les trophozoïtes peuvent paraître plus ou moins carrés
  2. Les formes en bande caractérisent cette espèce.
  3. Les schizontes matures peuvent avoir des formes typiques de marguerite avec jusqu'à dix mérozoïtes.
  4. Les hématies ne sont pas hypertrophiées.
  5. Le grain de chromatine peut se trouver à la surface interne des trophozoïtes

Critères de diagnostic :-

  1. Rencontré seulement en Afrique
  2. Hématies hypertrophiées
  3. Formes en comète fréquentes (en haut à droite )
  4. Trophozoïtes larges et grossiers
  5. Les granulations de Schüffner, lorsqu'elles sont présentes, peuvent être bien prononcées.
  6. Schizontes matures similaires à ceux de P. malariae, mais plus larges et plus grossiers


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